Методы определения белка в моче. Белок в моче – методы определения и границы нормы (современное состояние проблемы)

Белок в моче: методы определения

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора .

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

Качественные,

Полуколичественные,

Количественные.

Качественные методы

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 - 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).

Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.

Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.

Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

кольцевая проба Геллера ,

проба с 15 – 20% сульфосалициловой кислотой ,

проба с кипячением, и другие.

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

метод Брандберга-Робертса-Стольникова ,

определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины . Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Количественные методы

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;

значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;

должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;

обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;

быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);

обладать приемлемой стоимостью;

быть легко адаптируемым к автоанализаторам;

результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

Турбидиметрические методы

К турбидиметрическим методам относятся:

определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),

определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),

определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Колориметрические методы

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

К ним относятся:

биуретовая реакция,

метод Лоури,

методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:

Понсо S (Ponceau S),

Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)

пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

Исходя из эмпирических данных, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул: протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L; протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S; протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L; протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B; протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S; протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L; где B – результат измерения с Кумасси G-250; L - результат измерения с реактивом Лоури; P - результат измерения с молибдатом пирогаллола; S - результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

Литература:

О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.

А. В. Козлов, "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.

В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», - Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.

В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова - Методы определения белка в моче (обзор литературных данных)

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, "Медицина", 197

Метод Брандберга–Робертса–Стольникова относится к полуколичественным методам определения общего белка в моче . В основу метода положена кольцевая проба Геллера , заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Реактивы

50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой .
Приготовление реактива Ларионовой: готовят насыщенный раствор хлорида натрия (20 – 30 г соли растворяют в 100 мл воды при подогревании, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают, фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты. Вместо азотной кислоты можно добавить 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Ход определения

В пробирку наливают 1 – 2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой), дают кислоте стечь со стенок пробирки (5 – 8 минут), иначе при наслаивании белковой мочи образуется муть вследствие смешения азотной кислоты на стенках пробирки с мочой, что мешает образованию отчетливого кольца. Поэтому следует предварительно приготовить серию пробирок с кислотой. Пипеткой осторожно по стенке пробирки наслаивают такое же количество профильтрованной прозрачной мочи, стараясь не взбалтывать жидкость в пробирке. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Время наслаивания считают за четверть минуты.

Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз и т. д. Разведение мочи делают в мерной центрифужной пробирке, наливая мочу до метки 1 мл и доливают водой до той метки, во сколько раз делается разведение. Содержимое пробирки тщательно перемешивают пастеровской пипеткой с баллоном. Если при разведении мочи появляется муть, то смесь нужно вновь отфильтровать и только прозрачный фильтрат наслаивать на азотную кислоту. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на литр (г/л). Подбирают такое разведение мочи, чтобы при наслаивании ее на азотную кислоту кольцо появилось на 2 – 3-й минуте.

В случае, если с неразведенной или разведенной мочой кольцо образуется между 1-й и 4-й минутой, можно пользоваться поправкой Эрлиха-Альтгаузена, для того, чтобы не разводить мочу дополнительно (это экономит время). Авторы предложили определить время появления нитевидного кольца и внести в расчет поправку на время. В этом случае количество белка рассчитывают, умножая 0,033 г/л на степень разведения и на поправку.

При образовании кольца до истечения 1 минуты необходимо сделать одно дробное разведение, а именно в 1,5 раза (две части мочи и 1 часть воды). Это разведение также учитывается при расчете количества белка в моче.

Пример определения общего белка в моче методом Брандберга-Робертса-Стольникова.

При наслоении мочи на реактив сразу образуется широкое кольцо. Разводят мочу в 4 раза (1 часть мочи + 3 части воды), наслаивают; получается сразу нитевидное кольцо. Нужно имеющееся разведение развести еще в 2 раза; при наслаивании этого разведения образуется кольцо через 1,5 минут. Дальше можно не разводить.

Расчет белка: мочу развели в 4 и 2 раза, следовательно, в 8 раз. Количество белка равно 0,033*8*1 1 / 4 = 0,33 г/л

Недостатки метода Брандберга-Робертса-Стольникова:

субъективность,
трудоемкость,
снижение точности определения концентрации белка по мере разведения мочи.

См. также:

Литература:

Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова. - Москва, "Медицина", 1987 г
Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
А. Я. Альтгаузен, "Клиническая лабораторная диагностика" - Москва, Медгиз, 1959 г.
А. Я. Любина, Л. П. Ильичева и соавторы, "Клинические лабораторные исследования", Москва, "Медицина", 1984 г

Небольшое количество белка в суточной моче обнаруживается и у вполне здоровых лиц, однако такие небольшие концентрации не выявляют в разовых порциях используемыми в настоящее время методами. Приблизительно 70% белков мочи здорового человека приходится на долю уромукоида - белка, являющегося продуктом почечной ткани; таким образом, доля гломерулярного белка в моче здоровых людей является ничтожно малой и протеинурия в норме составляет 50-150 мг/сут, причем большинство белков мочи идентично сывороточным.

Принято различать следующие формы протеинурии в зависимости от места возникновения: преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом; ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть разделена на клубочковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией.

В зависимости от длительности существования выделяют постоянную протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и преходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации. Целесообразно различать вариабельность протеинурии: при суточной потере белка до 1 г - умеренную, от 1 до 3 г - среднюю и более 3 г - выраженную.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи. Наиболее точны методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле.
По результатам, полученным этими методами, можно судить о селективности протеинурии.

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой:

Необходимый реактив:

20%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

Ход исследования:

В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку прибавляют 6-8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной.

Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2-3 каплями 10%-ного раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова:

В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Необходимый реактив:

30%-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой.
Приготовление реактива Ларионовой: 20-30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.

Ход исследования:

В пробирку наливают 1-2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т.е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком - в 4 раза, при компактном - в 8 раз и т.д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л).

Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.

Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты:

Принцип метода:

Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы:

1. 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина - 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.

Специальное оборудование - фотоэлектроколориметр.

Ход исследования:

В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице.

Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод:

Принцип метода:

Пептидные связи белка с солями меди в щелочной с образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы:

1. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 20%-ный раствор меди (CuSO4∙5H2O).
3. 3%-ный раствор NaOH.

Ход исследования:

К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс - оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.

С помощью индикаторной бумаги (полосок):

Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок), которые выпускаются фирмами “Albuphan”, “Ames” (Англия), “Albustix”, “Boehringer” (Германия), “Comburtest” и др.

Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора.

При 3,0-3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0-3,5 для протекания реакции.

Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т.е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем, что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН
Число реагирующих аминогрупп в составе отдельных белков различно, поэтому альбумины реагируют в 2 раза интенсивнее, чем такое же количество γ-глобулинов (белок Бенс-Джонса, парапротеины), и гораздо интенсивнее, чем гликопротеиды. Однако при большом количестве слизи с высоким содержанием гликопротеидов (при воспалении мочевыводящих путей) оседающие на индикаторной полоске хлопья слизи могут давать ложноположительные результаты.

Чувствительность отдельных производственных серий индикаторной бумаги, равно как и отдельных видов бумаги, выпускаемых одной и той же фирмой, может быть различной, поэтому к количественной оценке белка этим методом следует относиться осторожно. Определение суточной потери белков с мочой при помощи индикаторной бумаги невозможно. Таким образом, индикаторная бумага уступает химическим пробам, в первую очередь пробе с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает возможность быстрого исследования серии образцов.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса:

Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема.

Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.

Принцип:

Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °С или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40-60 °С, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.

Необходимый реактивы:

2 М ацетатный буфер рН 4,9.

Ход исследования:

Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная.

С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Определение альбумоз (протеоз):

Альбумозы - это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде.

Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.

Необходимые реактивы:

1. Насыщенный раствор хлорида натрия.
2. Концентрированный раствор едкого натра.
3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).

Ход исследования:

К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.

При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.

Цель – определение белка в моче.

Показания – гипертензивные состояния при беременности, заболевания почек у беременной

Противопоказания – нет.

Возможные осложнения – нет

Ресурсы – судно, стерильная баночка, пробирки, 30% сульфосалициловая или 3% уксусная кислота, пипетка, спиртовая горелка.

Алгоритм действия:

1. Объясните беременной о необходимости определения белка в моче.

2. Попросите беременную собрать мочу в стерильную баночку.

3. Проба с сульфосалициловой кислотой: в пробирку налейте 4-5 мл мочи добавьте 6-10 капель кислоты. При наличии белка в моче образуется осадок или муть.

4. Проба с 3% уксусной кислотой: в пробирку налейте 8-10 мл мочи, прокипятите на спиртовой горелке, если в моче содержится белок она помутнеет. К помутневшей моче добавьте несколько капель 3% раствор уксусной кислоты. Если в моче исчезнет муть – проба отрицательная.

ПРИМЕЧАНИЯ Определяется в приемном отделении родовспомогательного учреждения.

Стандарт «Определение даты предполагаемого срока родов».

Цель: оценить практическое умение выпускника приопределении даты предполагаемого срока родов

Показания – каждое обращение в родовспомогательное учреждение беременной.

Противопоказания – нет

Возможные осложнения – нет

Ресурсы – стол, два стула, календарь, акушерский календарь, письменная информация о дате первого дня последней менструации, первой явки в женскую консультацию, дате УЗИ с заключением, дату дородового отпуска

Алгоритм действия:

Представьтесь, объясните женщине значение подсчета предполагаемого срока родов.
Выясните у беременной первый день последней менструации, к этой дате прибавьте 280 дней, или же по формуле Негеле к 1 дню последней менструации прибавьте 7 дней и отнимите 3 месяца, полученная дата является сроком родов по менструации.
Выясните дату первого шевеления плода, к этому дню у первородящей прибавьте 140 дней и у повторнородящей 154 дня, полученная дата является сроком родов по шевелению плода.
По менструальному циклу определите на какой день произошла последняя овуляция и от первого дня последней менструации отсчитайте назад три месяца и прибавляет количество дней до овуляции, получите дату родов.
Подсчитайте срок родов по первой явке в женскую консультацию. Ошибка будет минимальной, если беременная обратилась к врачу во время первых 12 недель беременности.
Определите срок родов по дате дородового отпуска. Срок дородового отпуска начинается с 30 недель беременности. К этой дате прибавляет 10 недель, получает дату родов.
Подсчитайте срок родов по УЗИ, проведенных в женской консультации.

Стандарт «Осмотр наружных половых органов»

Цель: оценить практические умения выпускника при осмотре наружных половых органов беременной

Показания – первичное обращение в родовспомогательное учреждение беременной, поступление в стационар с регулярной родовой деятельностью.

Противопоказания – нет

Возможные осложнения – нет

Ресурсы – фантом женщины, кушетка, одноразовое белье для кушетки

Алгоритм действия:

1. Представьтесь, объясните женщине значение осмотре наружных половых органов, этапы его проведения, получите ее согласие

2. Проведите гигиеническую дезинфекцию рук

3. На обе руки наденьте стерильные перчатки.

4. Произведите осмотр наружных половых органов: оцените тип оволосения, строение больших и малых половых губ, клитора, состояние промежности.

5. Большим и указательным пальцами обеих рук раздвиньте большие половые губы, осмотрите состояние наружного отверстия мочеиспускательного канала, преддверие влагалища, пропальпируйте область бартолиниевых желез (нижняя треть больших половых губ).

6. Снимите однаразовые перчатки опустите в коробку безопасной утилизации.

7. Вымойте руки с мылом.

8. Предоставьте беременной информацию по состоянию наружных половых органов.

9. Сделайте запись в документации.

ПРИМЕЧАНИЕ Осмотр проводится конфиденциально, не унижая достоинство женщины.

Стандарт «Оказание экстренной помощи при эклампсии»

Цель: оценить практические умения выпускника оказание экстренной помощи при эклампсии

Показания – приступ судорог при эклампсии

Противопоказания – нет

Возможные осложнения – повторный приступ судорог, эклампсическая кома.

Ресурсы – муляж женщины, 25% раствор сульфата магнезии, шпатель, языкодержатель, шприц 20 мл, физиологический раствор 500 мл, система для внутривенного вливания, спирт, вата, жгут

Алгоритм действия:

1. При приступах судорог вызовите не отходя от пациентки весь свободный персонал и реанимационную бригаду.

2. Одновременно проведите следующие мероприятия:

· освободите дыхательные пути, открыв рот с помощью шпателя или ложки, обернутую марлей, вытяните язык языкодержателем.

· удалите слюну из полости рта, как только появился вдох, обеспечьте свободный доступ воздуха.

· после остановки судорог внутривенно введите стартовую дозу магнезии сульфата – 25%-20 мл в течение 10-15 минут.

3. Начните внутривенную инфузию 320 мл физиологического раствора с 80 мл – 25% раствором сульфата магнезии

4. Под контролем артериального давления и продолжающейся магнезиальной терапии переложите пациентку на носилки и транспортируйте в реанимационное отделение ближайшего родильного дома.

ПРИМЕЧАНИЕ

При эклампсии родоразрешение должно произойти после стабилизации состояния пациентки, но не позднее 12 часов от начала судорог.

Стандарт «Оказание экстренной помощи при тяжелой преэклампсии».

Цель: оценить практические умения выпускника по оказанию экстренной помощи при тяжелой преэклампсии

Показания – тяжелая преэклампсия

Противопоказания – во время приступа судорог

Возможные осложнения – приступ судорог, эклампсическая кома.

Ресурсы – муляж женщины, 25% раствор сульфата магнезии, шприц 20 мл, физиологический раствор 500 мл, система для внутривенного вливания, спирт, вата, жгут

Алгоритм действия:

1. Поставьте диагноз: «Тяжелая преэклампсия» при наличии одного из этих симптомов: головной боли, боли в эпигастральной области, нарушения зрения, мелькания мушек перед глазами, тошноты, рвоты, на фоне артериальной гипертензии (140/90 мм рт. ст. и выше) и протеинурии.

2. Вызовите не отходя от пациентки весь свободный персонал и реанимационную бригаду.

3. Одновременно проведите следующие мероприятия:

· уложите беременную на ровную поверхность, избегая повреждений и поверните голову пациентки набок.

· внутривенно введите стартовую дозу магнезии сульфата – 25%-20 мл в течение 10-15 минут.

4. Начните внутривенную инфузию 320 мл физиологического раствора с 80 мл – 25% раствором сульфата магнезии.

5. При АД равно и выше 160/100 мм.рт.ст. регулируйте артериальное давление назначением 10 мг нифедипина сублингвально, повторно через 30 минут 10 мг под контролем АД (поддерживать АД на уровне 130/90-140/95 мм.рт.ст.).

6. Под контролем артериального давления и продолжающейся магнезиальной терапии переложите пациентку на носилки и транспортируйте в реанимационное отделение ближайшего родильного дома.

ПРИМЕЧАНИЕ При появлении признаков передозировки сульфата магнезии ввести 10 мл 10% раствора глюконата Са внутривенно в течение 10 минут.

Стандарт «Амниотомия».

Цель – вскрытие плодного пузыря.

Показания – перед родовозбуждением, родостимуляцией, слабости родовой деятельности Противопоказания – угрожающие состояния матери или плода

Возможные осложнения – выпадение мелких частей плода, восходящая инфекция, ранение сосудов плодного пузыря, отслойка нормально расположенной плаценты

Ресурсы – гинекологическое кресло, индивидуальная пеленка, стерильные перчатки, антисептик для обработки наружных половых органов женщины, бранша пулевых щипцов.

Алгоритм действия:

1. Представьтесь.

2. Объясните женщине необходимость проведения данной операции.

3. Возьмите информированное согласие пациентки на процедуру

4. Уложите женщину на гинекологическое кресло, подстелив под неё одноразовую

5. Проведите обработку наружных половых органов женщины антисептическим раствором, на живот женщины положите стерильную пеленку.

6. Проведите гигиеническую дезинфекцию рук.

7. Оденьте одноразовые перчатки на обе руки.

8. Пальцами левой руки разведите половые губы, последовательно введите во влагалище

указательный, затем средний палец правой руки.

9. Браншу пулевых щипцов введите во влагалище между указательным и средним

пальцами.

10. Произведите прокол плодного пузыря.

11. В образовавшееся отверстие в плодном пузыре введите указательный палец, а затем средний палец, отверстие постепенно расширьте, оболочки сместите с головки. Околоплодные воды выпускайте медленно, под контролем пальцев (профилактика выпадение мелких частей, отслойку нормально расположенной плаценты).

13. Выведите пальцы.

14. Снимите перчатки и опустите в коробку безопасной утилизации.

15. Вымойте руки с мылом.

16. Данные запишите в историю родов.

ПРИМЕЧАНИЕ .

При многоводии делают маленькую дырочку и потихоньку выпускают воды. Необходимо контролировать темп излития вод, так как при быстром и резком их излитии возможно выпадение мелких частей плода. После отхождения вод женщине рекомендуется 30 минут полежать.

Является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора .

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

Качественные,
Полуколичественные,
Количественные.

Качественные методы

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

Моча должна иметь кислую реакцию . Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 - 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).
Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.
Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.
Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

проба с кипячением, и другие.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

Количественные методы

низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;
должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;
обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;
быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);
обладать приемлемой стоимостью;
быть легко адаптируемым к автоанализаторам;
результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

Турбидиметрические методы

К турбидиметрическим методам относятся:

определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
определение белка с бензетоний хлоридом.

Колориметрические методы

К ним относятся:

биуретовая реакция,
метод Лоури,
методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
- Понсо S (Ponceau S),
- Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
- пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой , углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L;
протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S;
протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L;
протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B;
протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S;
протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где:
B – результат измерения с Кумасси G-250;
L - результат измерения с реактивом Лоури;
P - результат измерения с молибдатом пирогаллола;
S - результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Литература:

О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
А. В. Козлов, "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.
В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», - Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова - Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. Кольцово, 2007 г.
Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, "Медицина", 1975 г.